Libro bianco sulla bioattività in vitro di ASEA™ concernente la tossicità e l'efficacia su
glutatione perossidasi, superossido dismutasi e fattori di trascrizione correlati
22 giugno 2010
Autore:
Dott. Gary L. Samuelson, consulente scientifico indipendente
Descrizione
Nella presente relazione tecnica vengono descritti diversi risultati preliminari ottenuti da esperimenti in vitro, eseguiti presso istituti di ricerca nazionali, allo scopo di studiare la bioattività di un determinato composto di segnalazione Redox, ASEA™, posto in contatto fisico diretto con cellule viventi. La ricerca ha riguardato specificamente la tossicità e l'efficacia antiossidante in vitro degli antiossidanti campione glutatione perossidasi (GPx) e superossido dismutasi (SOD) all'interno delle cellule viventi e la traslocazione di due fattori di trascrizione (NF-kB, NRF2), già oggetto di studi approfonditi, che notoriamente regolano la risposta tossica e la produzione di antiossidanti nelle cellule umane. Durante la ricerca è stato svolto uno studio preliminare sulla dipendenza da concentrazione e sulla proliferazione cellulare associate allo stress ossidativo indotto nelle cellule umane.
Obiettivi delle ricerche
Le ricerche sono state condotte con i seguenti obiettivi: (1) determinare l'eventuale insorgenza di segni di tossicità (attivazione di NF-kB) in caso di contatto fisico diretto tra un determinato composto di segnalazione Redox, ASEA™, e cellule viventi, (2) determinare eventuali variazioni nell'efficacia antiossidante della glutatione perossidasi (GPx) e del superossido dismutasi (SOD) in caso di un simile contatto diretto, (3) determinare, in caso di simile contatto, l'eventuale attivazione della trascrizione traslocazionale (NRF2) associata a una maggiore espressione di antiossidanti in cellule endoteliali umane viventi e verificare l'espressione di tali fattori di trascrizione mediante analisi western blot, (4) determinare l'effetto del composto di segnalazione Redox in questione sulla proliferazione cellulare di cellule umane e marker associati (LDH) relativamente alla vitalità e alla salute delle cellule, (5) determinare gli effetti di questo composto di segnalazione Redox su cellule sollecitate con citochine (cachessina), radiazioni e deprivazione di siero.
Panoramica della teoria
L'integratore di supporto immunitario ASEA™ contiene una miscela equilibrata di molecole di segnalazione Redox [sia del tipo a ossigeno reattivo (ROS) sia del tipo ridotto (RS)] che compaiono in
un'ampia gamma di sequenze e di attività di recettore nelle cellule umane. Ad esempio, quando per qualunque motivo (ad esempio tossine, rotture del DNA o infezioni) le cellule vengono danneggiate, i messaggeri chimici nativi di segnalazione Redox che si trovano all'interno delle cellule possono finire in una condizione di squilibrio, una condizione che il più delle volte si manifesta nell'accumulo di ossidanti intracellulari e ROS (stress ossidativo). La cellula così colpita attiva meccanismi di difesa e riparazione volti a ripristinare la corretta omeostasi di segnalazione Redox e il giusto funzionamento cellulare. Se i tentativi di riparazione falliscono e il ripristino del normale equilibrio omeostatico Redox risulta impossibile, nel giro di poche ore gli ossidanti in eccesso e il ROS presenti in tali cellule agevoleranno i processi apoptotici per la digestione e distruzione interna della cellula non funzionale. Le cellule limitrofe in buona salute, quindi, si divideranno per sostituirla. Per lo studio di questi processi è stato creato un campo scientifico a parte denominato "segnalazione Redox", per il quale sono disponibili letteralmente migliaia di riferimenti.
Se si trovano in condizione di squilibrio o isolamento, alcune molecole di segnalazione Redox provocano, per natura, risposte tossiche immediatamente riconoscibili quando vengono poste in contatto con cellule vive. Il perossido di idrogeno ne è un esempio. La reazione cellulare immediata alle sostanze tossiche comporta la traslocazione di NF-kB nel nucleo come azione preliminare alla risposta infiammatoria e altri meccanismi di difesa. L'ingresso di NF-kB nel nucleo è rilevabile visivamente in una cellula vivente mediante microscopio a fluorescenza con l'aiuto di molecole di riconoscimento fluorescenti. Il rilevamento di una traslocazione nucleare di NF-kB indica senza ombra di dubbio l'inizio di una risposta tossica. Questo metodo polivalente consente di rilevare anche tossicità di livello ridotto. Concentrazioni ridotte di perossido di idrogeno, ad esempio, producono una risposta tossica chiaramente distinguibile.
In risposta a uno stress ossidativo ridotto, un fattore di trascrizione separato, l'NRF2, si sposta nel nucleo e stimola una maggiore produzione di antiossidanti. Di nuovo, grazie all'utilizzo di molecole di riconoscimento fluorescenti è possibile rilevare la traslocazione di NRF2 nelle cellule con un microscopio a fluorescenza. La traslocazione nucleare di NRF2 è un meccanismo difensivo di seconda linea noto per la capacità di determinare una maggior produzione di enzimi e antiossidanti protettivi, come la glutatione perossidasi e il superossido dismutasi. Spesso la traslocazione di NRF2 è accompagnata dall'attivazione di NF-kB, mentre l'attivazione di NF-kB è quasi sempre preceduta dalla traslocazione di NRF2. Le sostanze che presentano una tossicità di livello ridotto, ad esempio le tracce di tossine utilizzate nell'omeopatia, sono state utilizzate per lungo tempo per attivare la sequenza di NRF2 e stimolare questi meccanismi naturali di difesa, riparazione e sostituzione.
L'efficacia enzimatica degli antiossidanti, come la glutatione perossidasi (GPx) e il superossido dismutasi (SOD), può essere stabilita attraverso test standardizzati ELISA che misurano la riduzione nel tempo di determinati ossidanti introdotti nei lisati cellulari dopo aver esposto le cellule viventi alla sostanza del test per un dato intervallo di tempo. I reagenti scelti per il test ELISA devono essere tali da non interferire o interagire con la sostanza del test. È inoltre necessario determinare sperimentalmente altri fattori critici, come ad esempio la durata dell'esposizione e la dipendenza dalla concentrazione.
Per determinare sperimentalmente le quantità di GPx o SOD nei lisati cellulari è possibile utilizzare i metodi western blot. Queste tecniche di separazione molecolare ben collaudate possono essere utilizzate per verificare direttamente se nel campione la quantità di tali enzimi antiossidanti è aumentata. La misurazione dell'efficacia antiossidante, tuttavia, rimane l'indicatore migliore della difesa antiossidante cellulare.
Per determinare la vitalità cellulare e la risposta generale ai fattori di sollecitazione cellulare, come ad esempio le radiazioni, le citochine e le tossine, di norma viene utilizzato anche il monitoraggio della proliferazione cellulare, delle conte cellulari e degli indicatori chimici di morte cellulare. La cachessina, ad esempio, è una tossina molto forte (una citochina) che determina risposte tossiche immediate e un accumulo di stress ossidativo nelle cellule esposte. Le cellule sottoposte a queste sollecitazioni mostrano una maggiore propensione all'apoptosi e muoiono, rilasciando in tal modo le proteine interne (come l'LDH) nel siero circostante.
Normalmente, quando l'introduzione di queste tossine e di questi fattori di sollecitazione determina condizioni di stress ossidativo in colture di cellule, la conta cellulare diminuisce, la proliferazione cellulare cala e i livelli di LDH nel siero aumentano, indicando che nella coltura le cellule stanno morendo. Il perossido di idrogeno, le radiazioni e la deprivazione di siero determinano risposte analoghe. Come indicato in precedenza, i messaggeri chimici di segnalazione Redox concorrono a livello basilare alle attività cellulari di ricezione e risposta ai fattori di sollecitazione. I messaggeri Redox mediano la produzione e l'azione degli antiossidanti per la protezione delle cellule e per la riparazione dei meccanismi necessari a sanare il DNA e i danni strutturali e mediano anche il processo apoptotico che sfocia nella morte cellulare.
Una maggiore concentrazione di tali messaggeri Redox nel siero può contribuire ad aumentare l'efficienza di questi normali processi cellulari. L'azione esatta di varie miscele di segnalazione Redox deve essere determinata sperimentalmente. Alcuni studi indipendenti non ancora pubblicati, che hanno utilizzato spettrometria di massa, spettrometria fluorescente e risonanza paramagnetica
elettronica hanno dimostrato, senza ombra di dubbio, l'esistenza di diverse molecole di segnalazione Redox nell'integratore di supporto immunitario ASEA™. La disciplina dell'elettrochimica Redox conferma anch'essa l'esistenza di tali molecole di segnalazione Redox. La stabilità di questa miscela equilibrata di molecole Redox è considerevolmente superiore alle aspettative. La constatazione che in questo integratore i gruppi funzionali instabili vengono preservati potrebbe essere spiegata dalla presenza, verificata in alcuni casi mediante spettrometria di massa, di determinati complessi molecolari in grado di impedire le interazioni con i radicali. L'esistenza di contratti per la tutela della proprietà intellettuale, tuttavia, non consente la pubblicazione dei dettagli.
Metodi sperimentali
La ricerca illustrata di seguito è stata condotta al meglio delle possibilità da un ricercatore del massimo livello presso un laboratorio nazionale e si pone come obiettivo l'individuazione di uno schema comportamentale di base delle cellule umane poste in contatto diretto con le molecole di segnalazione Redox di ASEA™.
1. Il dosaggio iniziale per gli studi in vitro è stato estrapolato da una dose pari a 10 ml di ASEA/kg ricavata da sperimentazioni umane.
2. Per determinare se ASEA altera l'attività enzimatica delle cellule epidermiche murine, sono stati utilizzati gli ELISA glutatione perossidasi (GPx) e superossido dismutasi (SOD).
3. Sono stati inoltre determinati i livelli di LDH (morte cellulare non specifica) e i tassi di proliferazione cellulare per diversi tipi di cellule esposti ad ASEA.
4. Per determinare se vi sono state variazioni nell'attività di enzimi antiossidanti, è stato eseguito un trattamento a base di ASEA di cellule polmonari endoteliali microvascolari (HMVEC-L) e i lisati cellulari sono stati analizzati mediante gli ELISA GSH-Px e SOD.
5. Le cellule HMVEC-L sono state trattate con una soluzione salina tamponata al fosfato (PBS) per il controllo negativo, ASEA con concentrazioni al 5 e al 20% e cachessina per il controllo positivo, al fine di determinare l'attività di traslocazione nucleare della sottounità p65 di NF-kB (trascrizione di citochina) a intervalli di 30, 60, 90 e 120 minuti. Per acquisire le immagini della risposta cellulare si è fatto ricorso a tecniche che utilizzano il microscopio a fluorescenza.
6. Il punto (4) è stato ripetuto, ma l'attività di traslocazione nucleare di P- Jun è stata determinata come estensione/verifica di tale punto.
Libro bianco sulla bioattività in vitro di ASEA™ concernente la tossicità e l'efficacia su
glutatione perossidasi, superossido dismutasi e fattori di trascrizione correlati
22 giugno 2010
7. Due colture di cellule HMVEC-L, la prima con cicli cellulari random normali e la seconda con deprivazione di siero, sono state trattate con concentrazioni ridotte di ASEA (< 1%) per determinare l'attività nucleare dell'NRF2 (trascrizione antiossidante) a intervalli di 30, 60, 90 e 120 minuti, mediante confronto con un controllo negativo (PBS).
8. Su frazioni citoplasmatiche e nucleari è stata eseguita un'analisi western blot, separata mediante centrifuga differenziale, di colture cellulari HMVEC-L deprivate di siero esposte a < 1% ASEA , seguita da un controllo con perossido di idrogeno per determinare gli eventi di fosforilazione (azione ossidante) nella frazione citoplasmatica e di NRF2 (trascrizione antiossidante) nella frazione nucleare a intervalli di 0, 30, 60, 90 e 120 minuti.
9. Fasi cellulari random normali di cellule HMVEC-L sono state esposte a radiazioni e quindi trattate con ASEA. Per determinare la sopravvivenza sono state eseguite conte cellulari.
10. L'efficacia della ricezione di cachessina in cellule HMVEC-L durante lo stadio di confluenza e durante lo stadio normale è stata determinata osservando le variazioni di attività LDH extracellulare e intracellulare nelle cellule esposte a diverse miscele di cachessina, PBS e soluzioni di ASEA.
